THÔNG TIN VÀ NHỮNG KẾT LUẬN MỚI CỦA LUẬN ÁN
Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CRISPR/Cas9 CHỈNH SỬA PROMOTER OsSWEET14 NHẰM NÂNG CAO TÍNH KHÁNG BỆNH BẠC LÁ Ở GIỐNG LÚA BẮC THƠM 7”
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học; Mã số: 94 20 201
Họ và tên nghiên cứu sinh: Vũ Hoài Sâm
Khóa đào tạo: Đợt 1 năm 2016
Người hướng dẫn khoa học:
1. GS.TS. Phạm Xuân Hội;
2. TS. Nguyễn Duy Phương
Cơ sở đào tạo: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam (VAAS)
I. TÓM TẮT NỘI DUNG LUẬN ÁN
CRISPR/Cas9 là công cụ chỉnh sửa gen tiên tiến, do cấu trúc đơn giản nhưng có hiệu quả cao nên nó được sử dụng phổ biến hiện nay cải tạo di truyền nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng. Giống lúa Bắc thơm 7 (BT7) là giống lúa thuần chất lượng cao, được ưu chuộng và trồng nhiều ở các tỉnh miền Bắc Việt Nam, nhưng lại rất mẫn cảm với bệnh bạc lá (vụ Mùa). Vì vậy, nghiên cứu nhằm nâng cao tính kháng bệnh bạc lá cho giống lúa Bắc thơm 7 là yêu cầu cấp bách, góp phần đảm bảo tính ổn định và hiệu quả cho sản xuất lúa gạo của Việt Nam. Gen OsSWEET14 được biết là một trong các gen nhiễm (gen S) và là đích tấn công của vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), do có chứa các yếu tố liên kết thụ thể (Effector binding element – EBE) trên vùng promoter liên kết với protein TAL tương thích của vi khuẩn Xoo. Ý tưởng gây đột biến chính xác promoter OsSWEET14 của giống lúa Bắc thơm 7 bằng công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 để nâng cao tính kháng bệnh bạc lá là rất thiết thực. Trên cơ sở đó, luận án đã thu được những kết quả như sau:
1. Đã tối ưu được quy trình nuôi cấy in vitro và chuyển gen vào IE lúa BT7 thông qua A. tumafaciens. Quy trình sử dụng dung dịch A. tumefaciens có OD600 đạt 0,3 để lây nhiễm vào IE 11-13 DAP, AS 150 μM cho bước đồng nuôi cấy trong 5 ngày; kháng sinh cefotaxime 200 mg/L, vancomycin 100 mg/L và hygromycin 50 mg/L cho bước chọn lọc mô sẹo; chất điều hòa sinh trưởng BAP 2 mg/L, NAA 0,2 mg/L và nước dừa 20% cho bước tái sinh chồi; hiệu suất chuyển gen đạt 20,67%.
2. Giống lúa BT7 mẫn cảm với 19/20 chủng VXO nghiên cứu, biểu hiện OsSWEET14 bị xâm nhiễm bởi 6 chủng VXO và chứa 4 EBE AvrXa7, PthXo3, Tal5 và TalC trên promoter OsSWEET14 trong hệ gen. Trình tự crRNA tác động vào 3 EBE AvrXa7, PthXo3 và Tal5 đã được ghép nối vào vector chuyển gen thực vật biểu hiện phức hệ CRISPR/Cas9. Vector tái tổ hợp đã được kiểm tra bằng PCR, cắt giới hạn và giải trình tự Nu.
3. Đã tạo được 8 dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen mang đột biến đồng hợp SW14-BT tại vị trí EBE AvrXa7, không chứa cấu trúc T-DNA trong hệ gen. Kiểu gen của các dòng lúa chỉnh sửa gen đã được khẳng định bằng PCR và giải trình tự SW14-BT.
4. Đột biến SW14-BT trong các dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen không gây ảnh hưởng tới một số đặc điểm nông sinh học chính của cây lúa như thời gian sinh trưởng, chiều cao cây, số nhánh, số hạt chắc trên bông, hàm lượng amylose. Hai dòng lúa BT7 mang đột biến thêm 3 Nu và mất 6 Nu tại vị trí 15 và 16 trên EBE AvrXa7 không tăng cường biểu hiện OsSWEET14 khi lây nhiễm với 3 chủng VXO_11, 60 và 96, thể hiện tính kháng hoàn toàn với chủng VXO_11, kháng nhẹ với chủng VXO_96 và không kháng VXO_60.
II. NHỮNG KẾT QUẢ MỚI CỦA LUẬN ÁN
– Điều kiện chuyển gen vào IE giống lúa BT7 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens đã được tối ưu; quy trình chuyển gen tối ưu đạt hiệu suất 20,68%.
– Gen OsSWEET14 hoạt động như một gen “nhiễm” quan trọng đối với bệnh bạc lá ở giống lúa BT7.
– Thiết kế thành công hệ thống vector chuyển gen mang cấu trúc biểu hiện phức hệ CRISPR/Cas9 chỉnh sửa SW14-BT.
– Ứng dụng thành công hệ thống CRISPR/Cas9, thu được tám dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen mang đột biến SW14-BT ở dạng đồng hợp, không chứa cấu trúc T-DNA trong hệ gen.
– Hai dòng lúa BT7 chỉnh sửa SW14-BT có đặc điểm nông sinh học chính tương tự giống lúa đối chứng không chỉnh sửa gen và thể hiện tính kháng hoàn toàn với chủng vi khuẩn VXO_11.
3. CÁC ỨNG DỤNG/KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG THỰC TIỄN HAY NHỮNG VẤN ĐỀ CÒN BỎ NGỎ CẦN TIẾP TỤC NGHIÊN CỨU
– Quy trình chuyển gen đã thiết lập có thể được ứng dụng để chuyển gen phôi non cho các giống lúa indica khác ở Việt Nam
– Vector nhị phân biểu hiện phức hệ CRISPR/Cas9 chỉnh sửa promoter OsSWEET14 có thể được sử dụng trong các nghiên cứu chỉnh sửa gen kháng bạc lá ở các giống lúa chủ lực khác của Việt Nam.
– Cần tiếp tục nghiên cứu tính ổn định di truyền các đột biến và tính kháng của các dòng lúa BT7 chỉnh sửa gen ở các thể hệ sau.
– Nghiên cứu đa dạng di truyền gen tal của quần thể Xoo Việt Nam để làm rõ cơ chế tương tác phân tử giữa các chủng Xoo Việt Nam và các giống lúa phổ biến trong sản xuất.
